震動厚切到IENF神經觀察：大鼠腳掌皮膚 150 μm 厚切病理研究

前言：皮膚神經纖維（IENF）觀察的切片挑戰

在神經病理學與疼痛研究中，表皮內神經纖維（Intraepidermal Nerve Fiber, IENF）密度的量化，是評估小纖維神經病變（Small Fiber Neuropathy）的黃金標準。然而，要清晰觀察這些細微的神經纖維，傳統的石蠟切片或常規的冷凍切片往往面臨極大的挑戰。為了保留皮下神經纖維的三維連續結構，研究人員通常需要進行「厚切片」（Thick Sectioning）。

近期，拓生科技（Toson Technology）的病理組織包埋切片染色服務團隊接獲一項具挑戰性的委託：針對「大鼠腳掌掌心皮膚」進行 150 μm 的厚切製備。本文將分享我們如何運用 Agarose 支撐包埋與低速震動切片機（Vibratome）技術，成功克服皮膚組織堅韌與結構保留的難題，為後續的免疫螢光染色與神經標記（如 PGP9.5）奠定完美基礎。

技術挑戰：為何大鼠腳掌皮膚難以厚切？

大鼠腳掌的掌心皮膚具有特殊的解剖結構，包含了極厚的角質層、堅韌的真皮層以及豐富的皮下組織。在進行 150 μm 這種極端厚度的切片時，面臨以下三大挑戰：

組織質地差異大：角質層堅硬，而皮下組織相對柔軟。在切片刀片劃過時，極易因為應力不均導致組織撕裂或角質層剝離。
切片厚度對 IHC 影響：如我們在組織切片厚度對 IHC 結果的影響一文中所探討，常規 IHC 切片厚度多在 3-5 μm。而 150 μm 的厚切片雖然能保留立體結構，但極易在切片過程中發生捲曲或碎裂。
傳統包埋法的侷限：若使用石蠟包埋，高溫脫水過程會導致組織嚴重收縮發硬，150 μm 厚切幾乎不可能完整收片；若使用 OCT 進行常規冷凍切片，150 μm 的厚度在解凍收片時也容易發生嚴重的冰晶破壞或結構崩解。

拓生科技解決方案：Agarose 支撐包埋與低速震動切片

為了完美保留大鼠腳掌皮膚的連續結構以供 IENF 觀察，拓生科技技術團隊捨棄了傳統的石蠟與 OCT 包埋，改採「Agarose（瓊脂糖）支撐包埋」結合「震動切片機（Vibratome）」的特殊製備工藝。

Agarose 支撐包埋技術：
我們將固定後的大鼠腳掌皮膚組織，精準定向並包埋於適當濃度的 Agarose 凝膠中。Agarose 凝膠能提供均勻且具彈性的物理支撐，有效緩衝切片時刀片對堅硬角質層與柔軟皮下組織之間產生的剪切力，防止組織在厚切過程中撕裂。
低速震動切片（Vibratome）工藝：
不同於傳統切片機依賴鋒利刀刃的直接切割，震動切片機利用刀片的高頻水平震動來「鋸開」組織。我們將震動頻率與推進速度調至最佳比例（低速推進），在液體槽（如 PBS 緩衝液）中進行水下切片。這種方式不僅避免了冷凍切片的冰晶損傷，液體環境更能讓 150 μm 的厚切片在切下後自然展開，完美避免了捲曲與皺褶。
完整性與目標區域的取捨：
在 150 μm 的厚度下，要維持整塊腳掌皮膚（包含所有邊緣）的 100% 絕對完整是非常困難的。拓生科技的病理技師在切片過程中，會將焦點集中於「皮下 IENF 相關目標區域」的完整保留。透過顯微鏡即時監控，我們確保關鍵的神經分佈區域結構連續且無損，為後續的 3D 影像重建提供最高品質的素材。

切片成果與後續應用

透過上述技術製備的 150 μm 大鼠腳掌皮膚厚切片，組織結構完整，無明顯刀痕或撕裂傷。這類高品質的厚切片，是進行全視野立體免疫螢光染色 (Immunofluorescence, IF)的絕佳材料。

在後續的實驗中，研究人員可利用 PGP9.5 等泛神經標記抗體進行螢光染色實戰。由於切片厚達 150 μm，抗體的穿透與孵育需要特殊優化（如延長孵育時間或使用 Triton X-100 增加通透性）。若您在抗體選擇或染色條件優化上遇到困難，拓生科技也提供專業的抗體測試服務，協助您找到最適合厚切片的染色方案。結合共軛焦顯微鏡的 Z-stack 掃描，即可完美重建出表皮內神經纖維（IENF）的 3D 立體網絡，精確量化神經密度變化。